Размер: px
Начинать показ со страницы:
Транскрипт
1 РЕПАРАЦИЯ ДНК 1 Системы репарации 1 Прямая репарация. Примеры 2 Эксцизионная репарация. Примеры и виды 3 Репарация ошибок репликации ДНК 4 Рекомбинантная (пострепликативная) репарация у бактерий 5 SOS-репарация Системы репарации ДНК достаточно консервативны в эволюции от бактерий до человека и наиболее изучены у Е. coli. Известны два типа репарации: прямая и эксцизионная (от англ. excision - вырезание). Прямая репарация Прямая репарация - наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза 1. Так действует, например, О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (фермент самоубийца), которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина У Е. coli может в 1 мин синтезироваться до 100 молекул этого белка. Аналогичный по функциям белок высших эукариот, очевидно, играет важную роль в защите от рака, вызываемого внутренними и внешними алкилирующими факторами. ДНК-инсертаза 2. АР-сайты могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНК-инсертазами (от англ. insert- вставлять). фотолиаза 3. Тиминовые димеры "расшиваются" путем прямой репарацци при участии фотолиаз, осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение. ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр. Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий, земноводных и человека. Эти ферменты нуждаются в разнообразных кофакторах (FADH, тетрагидрофолиевая кислота и др.), участвующих в фотохимической активации фермента. Фотолиаза Е. coli
2 представляет собой белок с молекулярной массой 35 кда, прочно связанный с олигорибонуклеотидом длиной нуклеотидов, необходимым для активности фермента. Примеры прямой репарации 1. Метилированное основание O6-mG диметилируется ферментом метилтрансфераза О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (фермент самоубийца), которая переносит метильную группу на один из своих остатков цистеина 2. АР-сайты могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНК-инсертазами (от англ. insert- вставлять). СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК метилированное основание O6-mG демитилируется ферментом метилтрансферазой, который переносит метильную группу на один из своих остатков аминокислоты цистеина Фотолиаза присоединяется к тиминовому димеру и после облучения этого комплекса видимым светом (нм) димер расшивается СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК Фотолиаза присоединяется к тиминовому димеру и после облучения видимым спектром света этот димер расшивается Эксцизионная репарация (от англ. excision - вырезание). ОПРЕДЕЛЕНИЕ Эксцизионная репарация включает удаление поврежденных азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.
3 МЕХАНИЗМ В эксцизионной репарации обычно принимают участие несколько ферментов, а сам процесс затрагивает не только поврежденный, но и соседние с ним нуклеотиды. УСЛОВИЯ Для эксцизионной репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК. Общая упрощенная схема эксцизионной репарации представлена на рис ЭТАПЫ Первым этапом эксцизионной репарации является вырезание аномальных азотистых оснований. Его катализируют группа ДНК-N-гликозилаз - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием. ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ: 3 У человека ДНК-N-гликозилазы обладают высокой субстратной специфичностью: разные ферменты этого семейства распознают и вырезают различные аномальные основания (8-оксогуанин, урацил, метилпурины и др.). У бактерий ДНК-N-гликозилазы такой субстратной специфичностью не обладает ОБЩИЕ ФЕРМЕНТЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НАЗВАНИЕ ФУНКЦИЯ МЕХАНИЗМ ДНК-N-гликозилазы вырезание аномальных азотистых оснований расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой АР-эндонуклеаза экзонуклеаза создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы выщепляет несколько нуклеотидов и азотистым основанием разрывает сахарофосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК КОНКРЕТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫЕ ШАГИ ЭТОГО МЕХАНИЗА: В результате действия ДНК-N-гликозилаз образуется АР-сайт, который атакуется ферментом АР-эндонуклеазой. Она разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте и тем самым создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы, которая последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК.
4 ЧТО ПРОИСХОДИТ ДАЛЕЕ: 4 В клетках бактерий освобожденное место заполняется соответствующими нуклеотидами при участии ДНК-полимеразы I, ориентирующейся на вторую (комплементарную) цепь ДНК. Поскольку ДНК-полимераза I способна удлинять З"-конец одной из цепей в месте разрыва в двуцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5"-конца того же разрыва, т.е. осуществлять ник-трансляцию, этот фермент играет ключевую роль в репарации ДНК. Окончательное сшивание репарированных участков осуществляет ДНК-лигаза. В клетках эукариот (млекопитающих) Эксцизионная репарация ДНК в клетках млекопитающих сопровождается резким всплеском активности еще одного фермента поли АDР-рибозополимеразы. При этом происходит ADP-рибозилирование белков хроматина (гистонов и негистоновых белков), что ведет к ослаблению их связи с ДНК и открывает доступ ферментам репарации. Донором ADP-рибозы в этих реакциях выступает NAD+, запасы которого сильно истощаются при эксцизионной репарации повреждений, вызываемых рентгеновским облучением: Отрицательно заряженные остатки ADP-рибозы из внутреннего состава молекулы NAD+ присоединяются через радикал глутаминовой кислоты или фосфосерина к белкам хроматина, что ведет к нейтрализации положительных зарядов этих белков и ослаблению их контакта с ДНК. ЧТО ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ГРУППА ФЕРМЕНТОВ ДНК гликозилазы расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием
5 что приводит к вырезанию аномальных азотистых оснований 5 ДНК - гликозилазы, участвующие в устранении окислительных повреждений ДНК в клетках прокариот и эукариот, весьма разнообразны и отличаются по субстратной специфичности, пространственной структуре и способам взаимодействия с ДНК. К наиболее изученным ДНК-гликозилазам относятся: эндонуклеаза III (EndoIII), форм амидо пиримидин-днк-гликозилаза (Fpg), Mut T и Mut Y кишечной палочки. Эндонуклеаза III Е. coli "узнает" и специфически выщепляет из ДНК окисленные пиримидиновые основания. Этот фермент представляет собой мономерный глобулярный белок, состоящий из 211 аминокислотных остатков (мол. масса 23,4 кда). Ген, кодирующий Endo III, секвенирован, установлена его нуклеотидная последовательность. Endo III представляет собой железосерный белок [(4Fe-4S)2+-белок], обладающий элементом надвторичной структуры типа "греческий ключ" (спираль - шпилька - спираль), служащим для связывания с ДНК. Ферменты с аналогичной субстратной специфичностью и сходной аминокислотной последовательностью выделены также из клеток быка и человека. Форм амидо пиридин-днк-гликозилаза Е. coli "узнает" и выщепляет из ДНК окисленные гетероциклические основания пуринового ряда. СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ СТАДИЯ 1 ДНК N гликозидаза удаляет поврежденное основание АР эндонуклеаза вносит разрыв в ДНК СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ 1 ДНК N гликозидаза удаляет поврежденное основание АР эндонуклеаза вносит разрыв в ДНК 2 Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов
6 3 ДНК полимераза заполняет освободившийся участок комплементарными Мононуклеотидами ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК 6 Mut T - небольшой белок с молекулярной массой 15 кда, обладающий нуклеозидтрифосфатазной активностью, который преимущественно гидролизует dgtp до dgmp и пирофосфата. Биологическая роль Mut T заключается в предотвращении образования во время репликации неканонических пар А:G и А: 8-oxo-G. Такие пары могут появляться в том случае, когда окисленная форма dgtp (8-oxo-dGTP) становится субстратом ДНК-полимеразы. Mut T гидролизует 8-oxo-dGTP в 10 раз быстрее, чем dgtp. Это делает 8-oxo-dGTP наиболее предпочтительным субстратом Mut T и объясняет его функциональную роль. Mut Y представляет собой специфическую аденин-днк-гликозилазу, расщепляющую N-гликозидную связь между аденином и дезоксирибозой аденозина, образующего неканоническую пару с гуанином. Функциональная роль этого фермента заключается в предотвращении мутации T:A - G:A путем отщепления неповрежденного остатка аденина из пары оснований A: 8-oxo-G.
7 Нуклеотидная эксцизионная репарация (АТФ-зависимый механизм удаления повреждений из ДНК) В последнее время в эксцизионной репарации особое внимание уделяют АТРзависимому механизму удаления повреждений из ДНК. Этот вид эксцизионной репарации получил название нуклеотидная эксцизионная репарация (nucleotide excision repair; NER). Она включает в себя ДВА ЭТАПА: 1. удаление из ДНК олигонуклеотидных фрагментов, содержащих повреждение, и Эксинуклеаза фермент, удаляющий фрагменты ДНК 2. последующую реконструкцию цепи ДНК с участием комплекса ферментов (нуклеаз, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и др.). Удаление фрагмента ДНК происходит по обе стороны поврежденного нуклеотида. Длина удаляемых олигонуклеотидных фрагментов отличается у прокариот и эукариот. Удаление фрагмента ДНК у прокариот Так, у Е. coli, В. subtilus, Micrococcus luteus вырезается фрагмент длиной нуклеотидов, Удаление фрагмента ДНК у эукариот а у дрожжей, земноводных и человека - фрагмент, состоящий из нуклеотидов. Эксинуклеаза фермент, удаляющий фрагменты ДНК Выщепление фрагмента ДНК осуществляется ферментом эксинуклеазой (excinuclease). У Е. coli этот фермент состоит из 3 различных протомеров uvra uvr В uvr С каждый из которых выполняет определенную функцию в ходе эксцизионного выщепления фрагмента ДНК. Название этих белков дано по первым буквам слов "ultra violet repair". Протомер uvr А обладает АТРазной активностью, связывается с ДНК в виде димера, осуществляя первичное распознавание повреждения и связывание uvr В Протомер uvr В обладает: 1. Латентной АТР-азной и латентной хеликазной активностью, необходимой для изменения конформаций и расплетания двойной спирали ДНК; 7
8 2. Эндонуклеазной активностью, расщепляя межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь со стороны З"-конца выщепляемого фрагмента. Протомер uvr С действует как эндонуклеаза, вносящая разрыв в репарируемую цепь ДНК с 5"-конца вырезаемого фрагмента. Таким образом, протомеры uvr A, uvr В, uvr С взаимодействуют с ДНК в определенной последовательности, осуществляя АТР-зависимую реакцию выщепления олигонуклеотидного фрагмента из репарируемой цепи ДНК. Образовавшаяся брешь в молекуле ДНК реставрируется при участии ДНКполимеразы I и ДНК-лигазы. Модель эксцизионной репарации с участием вышеперечисленных ферментов представлена на рис Эксцизионные репарации у человека Эксцизионные репарации у человека также имеют АТФ - зависимый характер и включают три основных этапа: узнавание повреждения, двойное разрезание цепи ДНК, восстановительный синтез и лигирование репарируемой цепи. Однако, в эксцизионной репарации ДНК человека принимают участие 25 различных полипептидов, 16 из которых участвуют в выщеплении олигонуклеотидного фрагмента, являясь протомерами эксинуклеазы, а остальные 9 осуществляют синтез репарируемого участка молекулы. В репарационной системе ДНК у человека весьма существенную роль выполняют белки транскрипции РНК-полимераза II и TF ПН - один из шести основных факторов транскрипции эукариот. Следует отметить, что эксцизионная репарация у прокариот, как и у эукариот, зависит от функционального состояния ДНК: транскрибируемая ДНК репарируется быстрее, чем транскрипционно неактивная. Этот феномен объясняется следующими факторами: структурой хроматина, гомологией цепей транскрибируемых участков ДНК, эффектом повреждения цепей и его влиянием на РНК-полимеразу. ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ: КОДИРУЮШАЯ ЦЕПЬ ДНК (цепь хранения информации) МАТРИЧНАЯ ЦЕПЬ ДНК (с неё происходит списывание информации) 8
9 Известно, что такие крупные повреждения, как образование тиминовых димеров, блокируют транскрипцию как у бактерий, так и у человека, если они происходят на матричной цепи ДНК (повреждения на кодирующей цепи не влияют на транскрипционный комплекс). РНК-полимераза останавливается в месте повреждения ДНК и блокирует работу транскрипционного комплекса. 9 Транскрипционно-репарационный фактор сцепления (TRCF). У Е. coli усиление репарации при транскрипции опосредуется одним специальным белком - транскрипционно-репарационным фактором сцепления (TRCF). Этот белок способствует: 1. отсоединению РНК-полимеразы от ДНК 2. одновременно стимулирует образование комплекса белков, осуществляющих репарацию поврежденного участка. По окончании репарации РНК-полимераза встает на место и транскрипция продолжается (см. рис.). Итак общая схема эксцизионной репарации 1. ДНК-N-гликозилаза удаляет поврежденное основание 2. АР эндонуклеаза вносит разрыв в цепь ДНК 3. Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов 4. ДНК-полимераза заполняет освободившийся участок комплементарными нуклеотидами 5. ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК Репарация ошибок репликации ДНК путем метилирования Ошибки спаривания азотистых оснований во время репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на 10 тыс. нуклеотидов), в результате которых в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотидам материнской цепи нуклеотиды - мисмэтчи (англ. mismatch не соответствовать). Несмотря на то, что ДНК-полимераза I прокариот обладает способностью к самокоррекции, ее усилия по устранению ошибочно присоединенных нуклеотидов иногда оказываются недостаточны, и тогда в ДНК остаются некоторые неправильные (некомплементарные) пары. В этом случае репарация происходит с использованием определенной системы, связанной с метилированием ДНК. Действие этой системы репарации основано на том, что после репликации через определенное время (несколько минут) ДНК подвергается метилированию. У Е. coli метилируется в основном аденин с образованием N6-мeтил-аденина (N6-mA).
10 До этого момента вновь синтезированная (дочерняя) цепь остается неметилированной. Если в такой цепи есть неспаренные нуклеотиды, то она подвергается репарации: Таким образом метилирование метит ДНК и включает систему исправления ошибок репликации. В этой системе репарации узнаются особые структуры: последовательность G-N6-mA-T-С и следующая за ней деформация в двойной спирали в месте отсутствия комплементарности (рис. ниже). В устранении неспаренных нуклеотидов в полуметилированной молекуле ДНК принимает участие достаточно сложный комплекс ферментов репарации, который сканирует поверхность молекулы ДНК, вырезает участок дочерней цепи, прибегающей к мисмэтчам, а затем создает условия для застраивания его нужными (комплементарными) нуклеотидами. Различные компоненты этого комплекса обладают разными активностями нуклеазной, хеликазной, АТРазной, необходимыми для внесения разрывов в ДНК и выщепления нуклеотидов, расплетания двойной спирали ДНК и энергетического обеспечения движения комплекса вдоль репарируемой части молекулы. Сходный по структуре и функциям комплекс ферментов репарации выявлен и у человека. Рекомбинантная (пострепликативная) репарация 10 В тех случаях, когда по тем или иным причинам вышерассмотренные системы репарации оказываются нарушенными, в цепях ДНК могут образовываться бреши (недорепарированные участки), имеющие иногда весьма существенные размеры, что чревато нарушением системы репликации и может привести к гибели клеток. В этом случае клетка в состоянии использовать для репарации одной молекулы ДНК другую полученную после репликации молекулу ДНК, т. е. привлечь для этой цели механизм рекомбинации. У бактерий У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие белок Rec А. Он связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными участками неповрежденных цепей другой молекулы ДНК. В результате и разорванная (содержащая бреши), и неповрежденная цепи репарируемой молекулы ДНК оказываются спаренными с неповрежденными
11 комплементарными участками ДНК, что открывает возможность репарации путем вышеохарактеризованных систем. При этом могут происходить вырезание определенного фрагмента и заполнение с его помощью бреши в дефектной цепи. Возникающие при этом пробелы и разрывы в цепях ДНК восполняются с участием ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы. SOS-репарация Существование этой системы впервые постулировал М. Радман в 1974 г. Он же дал название этому механизму, включив в него международный сигнал бедствия "SOS" (спасите наши души). И действительно, эта система включается тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки. В этом случае происходит индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах, сопряженных с репарацией ДНК. Включение тех или иных генов, определяемых количеством повреждений в ДНК, приводит к разным по значимости клеточным ответам (начиная со стандартной репарации поврежденных нуклеотидов и кончая подавлением клеточного деления). Наиболее изучена SOS-репарация у Е. coli, главными участниками которой являются белки, кодируемые генами Rec A и Lex А. Первый из них представляет собой полифункциональный белок Rec A, участвующий в рекомбинации ДНК, а также в регуляции транскрипции генов фага лямбда, поражающего Е. coli, а второй (белок Lex А) является репрессором транскрипции большой группы генов, предназначенных для репарации ДНК бактерий. При его ингибировании или разрешении репарация активируется. Связывание Rec А с Lex А приводит к расщеплению последнего и соответственно к активации генов репарации. В свою очередь, индукция SOS-системы бактерии служит для фага лямбда сигналом опасности и приводит к тому, что профаг переключается с пассивного на активный (литический) путь существования, вызывая тем самым гибель клеткихозяина. SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у животных, и человека. 11
12 12 Гены, задействованные в SOS-репарации повреждений ДНК Гены uvr А, В, С, D Rec А lex А rec N, ruv ssb umu С, D sul А Последствия активации гена Репарация повреждений вторичной структуры ДНК Пострепликативная репарация, индукции SOS-системы Выключение SOS-системы Репарация двунитевых разрывов Обеспечение рекомбинационной репарации Мутагенез, вызванный изменениями свойств ДНК-полимеразы Подавление клеточного деления Заключение Исправление повреждений в ДНК тесным образом связано с другими фундаментальными молекулярно-генетическими процессами: репликацией, транскрипцией и рекомбинацией. Все эти процессы оказываются переплетенными в общую систему взаимодействий, обслуживаемую большим числом разнообразных белков, многие из которых являются полифункциональными молекулами, задействованными в контроле реализации генетической информации в клетках про- и эукариот. В то же время очевидно, что природа "не скупится" на элементах контроля, создавая сложнейшие системы коррекции тех повреждений в ДНК, которые несут опасность для организма и особенно для его потомства. С другой стороны, в тех случаях, когда репарационных возможностей недостаточно для сохранения генетического статуса организма, наступает необходимость в программируемой клеточной смерти апоптозе.. МАТЕРИАЛ И ПРИВЕДЕННЫЕ ДАЛЕЕ СХЕМЫ ВЗЯТЫ ИЗ РУКОВОДСТВА Кирпичев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология М. AKADEMA C.
13 СХЕМА НУКЛЕОТИДНОЙ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ У E.COLI С УЧАСТИЕМ ЭКСИНУКЛЕАЗЫ 1. ТРАНСКРИПЦИОННО НЕЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ 13
14 2. ТРАНСКРИПЦИОННО ЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ 14
15 3. ОБЩИЙ ЭТАП РЕПАРАЦИИ 15 УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ А - белок uvr А Б - белок uvr В С - белок uvr С маленький черный треугольник знак указывает на место повреждений
16 СХЕМА РЕПАРАЦИИ, СВЯЗАННАЯ С МЕТИЛИРОВАНИЕМ ДНК 16
Репарация ДНК Типы мутаций на генном уровне Типы изменений в генах Замены (в.т.ч изза модификациии нуклеотидов) Делеции Вставки Транслокации Дупликации Инверсии По последствиям точковые мутации бывают:
Репарация ДНК Репарация ДНК Первичная структура ДНК является динамичной и подвергается постоянным изменениям. Изменения в молекулярной структуре генетического материала являются повреждениями ДНК. Повреждение
Молекулярно-генетический уровень характеризует: Репликация ДНК, репарация ДНК, мутации ДНК, рекомбинации молекул ДНК транскрипция ДНК трансляция РНК Составляют элементарные генетические процессы обеспечивающие
СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНОГО МАТЕРИАЛА 1. ВВЕДЕНИЕ Предмет и задачи молекулярной биологии. История ее развития и основные достижения. 2. СТРОЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Химический состав
Глава 7 Репликация ДНК 1. CS Репликация это процесс присущий: a) только эукариотам; b) только прокариотам; c) только вирусам; d) всем живым системам; e) все ответы неверные. 2. CS Репликация это процесс:
Вопросы к экзамену (зачету) Молекулярная биология лекции С.В. Разина Билет 1. 1. Кольцевые молекулы ДНК и понятие о сверхспирализации ДНК. Параметры сверхспирализованной ДНК и конформационные переходы
7 РЕПЛИКАЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК Репликация ДНК это молекулярный процесс точного копирования молекул ДНК (ее нуклеотидной последовательности). С помощью механизма репликации происходит точная передача генетической
Лекция 7 Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК Нуклеиновые кислоты ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) ирнк (рибонуклеиновая кислота) линейные полимеры, мономерами которых
Биохимия Лекция 3 ДНК Дезоксирибонуклеи новая кислота (ДНК) макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых
Генетическая рекомбинация - это перераспределение генетического материала (ДНК), приводящее к возникновению новых комбинаций генов. Рекомбинация может происходить путем обмена клеточными ядрами, целыми
РЕКОМБИНАЦИЯ Генетическая рекомбинация - это перераспределение генетического материала (ДНК), приводящее к возникновению новых комбинаций генов. Пути рекомбинации: - обмен клеточными ядрами - обмен целыми
Основные генетические механизмы Тренинг «Использование методики Xpert MTB/RIF», г.душанбе, 29 июля 2 августа 2013 г. Презентация подготовлена в рамках проекта USAID «Посилення контролю за туберкульозом
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ мультиферментный комплекс (ДНК-репликазная система), которая включает около 20 основных ферментов и белковых факторов единица процесса репликации
Глава I. Основы цитологии На дом: 12 Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК» Задачи: Дать характеристику нуклеиновым кислотам: видам НК, локализации их в клетке, строению, функциям. Изменено, дополнено Нуклеиновые
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК ЭУКАРИОТ Организм Количество репликонов Средний размер репликона, тыс.п.н. Скорость движения репликативной вилки, п.н./сек. 1 4200 50000 500 40
ПРОЦЕССИНГ ДНК И РНК При жизни организма непрерывно происходят процессы обновления тканей, клеток и т.д., которые неизбежно включают процессы копирования и передачи информации, хранящейся в геноме. Направления
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. ПРОЦЕССИНГ РИБОСОМАЛЬНЫХ И ТРАНСПОРТНЫХ РНК. синтез молекул РНК, образование первичного транскрипта (пре-рнк) (посттранскрипционные модификации) модификация
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. ТРАНСКРИПЦИЯ РНК ПРОКАРИОТ участок ДНК, являющийся единицей транскрипции РНК транскриптон прокариотических организмов в широком смысле структурная и функциональная
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. БИОСИНТЕЗ ЛЕКЦИЯ 3 План лекции 1. РЕПЛИКАЦИЯ 2. ТРАНСКРИПЦИЯ РЕПЛИКАЦИЯ Лекция 3. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Словарь Реплисома мультиферментный комплекс (ДНКрепликазная система),
1.2. Поток генетической информации у прокариот Организация прокариотического гена Транскрипция у прокариот Трансляция у прокариот +/- ДНК и РНК Репарация ДНК Поток генетической информации у прокариот Ранние
Учитель биологии ГБОУ СОШ 277 Кировского района Буянов А.В. Название «нуклеиновые кислоты» происходит от латинского слова «нуклеус», т.е. ядро. Они впервые были обнаружены и выделены из ядер клеток. Этот
Организация наследственного материала (I) Вопросы: 1. Строение и функции нуклеиновых кислот. 2. Репликация ДНК. 3. Генетический код и его свойства. 4. Реализация генетической информации в клетке. Биосинтез
Ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков. Рибосомальная РНК составляет большую долю (до 80%)
Занятие 6. Тема: ОРНИЗИЯ НСЛЕДСТВЕННОО МТЕРИЛ (занятие I) " " 200 г ель занятия: изучить молекулярную природу гена, его свойства; научиться решать задачи, раскрывающие строение молекул ДНК и РНК, по репликации,
Задания для внеаудиторной работы студентов специальности медицинская биохимия 1 курс. Резюме - краткое изложение информации по какому-либо изученному материалу. Необходимо изложить пройденную тему в 5-7
Репликация ДНК Биосинтез белка Репликация удвоение молекулы ДНК Происходит в S (синтетический)период митотического цикла Образующиеся дочерние молекулы - точные копии материнской Принципы репликации Комплементарность
Молекулярная биология Лекция 12. Регуляция. Скоблов Михаил Юрьевич Часть 1. Регуляция активности генов у прокариот Парадокс количества и сложности: Эволюционное качество достигается не количеством генов,
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО НАУЧНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Билеты вступительного экзамена в аспирантуру
Нуклеопротеины (ДНП и РНП) сложные белки, небелковым компонентом которых являются нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК). Нуклеиновые кислоты (от лат. Nucleus ядро) это полинуклеотиды, неразветвленные и нерегулярные,
Генный уровень организации наследственного материала. Ген - единица наследственной информации: занимающая определенное положение в хромосоме, контролирующая выполнение определенной функции, определяющая
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ период жизни клетки от одного деления до другого или от деления до смерти Y-образная структура, перемещающаяся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующаяся
Занятие 4. ТРАНСКРИПЦИЯ ДНК Цель занятия: ознакомиться с процессами транскрипции ДНК у про- и эукариот и особенностями организации их генов. 1. Транскрипция прокариот 2. Транскрипция эукариот 3. Нематричный
Глава 11 Методы анализа генов 1. CS Ферменты рестрикции: a) используются в ПЦР; b) узнают одноцепочечную ДНК; c) узнают и разрезают специфические двуцепочечные последовательности ДНК; d) встречаются у
Рестриктазы - группа бактериальных нуклеаз. Рестриктазы - это ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью, которые специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных
Характеристика ДНК и РНК ДНК выполняет следующие функции: 1. Участвует в копировании генетического материала (репликации) и передаче его дочерним клеткам в ходе их деления. 2. Обеспечивает - экспрессию
Синтез ДНК Реализация наследственной информации Заведующий кафедрой биологии, профессор Колесников О.Л. Особенности ДНК-полимеразы Синтез новой цепи идет в направлении от 5 к 3 концу цепи Фермент может
Учитель биологии Зозуля Е.В.. Ноябрь 2014. Решение задач по молекулярной биологии. Молекулярная биология изучает механизмы хранения и передачи наследственной информации. Задачи по молекулярной биологии
ЖИЗНЬ КЛЕТКИ: БИОСИНТЕЗ БЕЛКА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ РЕПАРАЦИЯ интерфаза Клеточный цикл = ИНТЕРФАЗА + М-фаза пресинтетический период G1 (синтез РНК, рибосом, нуклеотидов, белков, синтез АТФ, деление МХ и хлоропластов,
Решение биологических задач на тему «Генетический код. Биосинтез белка» Типы задач 1. Определение последовательности аминокислот в фрагменте молекулы белка на основании последовательности нуклеотидов ДНК
УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ ОБЩАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА ЗАДАЧИ Под редакцией профессора М.М. Азовой Министерство образования и науки Р Рекомендовано Координационным советом по области образования «Здравоохранение
Глава 9 Транскрипция и процессинг РНК 1. СS Кэпирование про-мрнк обеспечивает: a) репликацию ДНК; b) репарацию ДНК; c) стабильность молекул РНК; d) денатурацию ДНК; e) сплайсинг. 2. CS В транскрипции участвует:
Занятие 3. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК Цель занятия: ознакомиться с процессами репликации ДНК. 1 Матричные процессы синтеза биополимеров. Белки и ферменты, участвующие в репликации ДНК. Общая характеристика репликации
ëóèùâapple Ç.ç., 997 REPAIR OF GENETI DAMAGE V. N. SOYFER The following mechanisms of repair are described: direct repair, excision of damages based by glycosylases, nucleotides" excision, repair of mismatched
Нуклеиновые кислоты Нуклеиновые кислоты и их роль в жизнедеятельности клетки Нуклеиновые кислоты открыты во второй половине 19 века швейцарским биохимиком Фридрихом Мишером Фридрих Мишер Нуклеиновые кислоты
Тема 1. Химический состав клетки Задания части А Выберите один ответ, который является наиболее правильным 1. Назовите органические соединения, которые содержатся в клетке в наибольшем количестве (в %
Р Радикальная замена аминокислоты мутационная замена, приводящая к значительным изменениям структуры и функции белка. Рамка считывания один из трех возможных способов считывания нуклеотидной последовательности
ЗАПОРОЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ МАТРИЧНЫЕ СИНТЕЗЫ: РЕПЛИКАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИЯ ТРАНСЛЯЦИЯ МАТРИЦА форма, применяемая при штамповке, отливке РЕПЛИКА- копия, отпечаток,
Молекулярная биология Лекция 7. Репликация и репарация. Скоблов Михаил Юрьевич Часть 1. Репликация ДНК Эксперимент Мезельсона и Сталя 1958 год ДНК-полимераза В 1956 г. Корнберг выделил из клеток бактерии
Предлагаемая книга является первым наиболее полным и авторитетным руководством по интенсивно развивающейся области науки молекулярной генетике, аналогов которому в мировой научной литературе нет. Издание
План лекции 1.Типы повреждений ДНК 1.Типы повреждений ДНК 2.Репарация ДНК, типы и механизмы: 2.Репарация ДНК, типы и механизмы: Прямая Прямая Эксцизионная Эксцизионная Пострепликативная Пострепликативная SOS репарация SOS репарация 3. Репарация и наследственные болезни 3. Репарация и наследственные болезни
Процесс восстановления исходной нативной структуры ДНК называют репарацией ДНК, или генетической репарацией, а системы, участвующие в нем - репарационными. Процесс восстановления исходной нативной структуры ДНК называют репарацией ДНК, или генетической репарацией, а системы, участвующие в нем - репарационными. В настоящее время известно несколько механизмов генетической репарации. Одни из них более просты и «включаются» сразу же после повреждения ДНК, другие требуют индукции большого числа ферментов, и их действие растянуто во времени. В настоящее время известно несколько механизмов генетической репарации. Одни из них более просты и «включаются» сразу же после повреждения ДНК, другие требуют индукции большого числа ферментов, и их действие растянуто во времени.
С позиций молекулярного механизма первичные повреждения в молекулах ДНК могут быть устранены тремя путями: С позиций молекулярного механизма первичные повреждения в молекулах ДНК могут быть устранены тремя путями: 1.прямым возвращением к исходному состоянию; 1.прямым возвращением к исходному состоянию; 2. вырезанием поврежденного участка и заменой его нормальным; 2. вырезанием поврежденного участка и заменой его нормальным; 3. рекомбинационным восстановлением в обход поврежденного участка. 3. рекомбинационным восстановлением в обход поврежденного участка.
Спонтанные повреждения ДНК Ошибки репликации (появление некомплементарных пар нуклеотидов) Ошибки репликации (появление некомплементарных пар нуклеотидов) Апуринизация (отщепление азотистых оснований из нуклеотида) Апуринизация (отщепление азотистых оснований из нуклеотида) Дезаминирование (отщепление аминогруппы) Дезаминирование (отщепление аминогруппы)
Индуцированные повреждения ДНК Димеризация (сшивание соседних пиримидиновых оснований с образованием димера) Димеризация (сшивание соседних пиримидиновых оснований с образованием димера) Разрывы в ДНК: однонитевые и двунитевые Разрывы в ДНК: однонитевые и двунитевые Поперечные сшивки между нитями ДНК Поперечные сшивки между нитями ДНК
ПРЯМАЯ РЕПАРАЦИЯ ДНК Этот тип репарации обеспечивает прямое восстановление исходной структуры ДНК или удаление повреждения. Этот тип репарации обеспечивает прямое восстановление исходной структуры ДНК или удаление повреждения. Широко распространенная система репарации такого рода фотореактивация пиримидиновых димеров. Широко распространенная система репарации такого рода фотореактивация пиримидиновых димеров. Это пока единственная, известная ферментная реакция, в которой фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. Это пока единственная, известная ферментная реакция, в которой фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. При этом активизируется фермент фотолиаза, которая разъединяет димеры. При этом активизируется фермент фотолиаза, которая разъединяет димеры.
Фоторепарация Схематически световая репарация выглядит следующим образом: 1. Нормальная молекула ДНК Облучение УФ-светом 2. Мутантная молекула ДНК – образование пиримидиновых димеров. Действие видимого света 3. Синтез фермента фотолиазы 4. Расщепление димеров пиримидиновых оснований 5. Восстановление нормальной структуры ДНК
Установлено, что большинство полимераз кроме 5"-3"-полимеразной активности имеют 3"-5"- экзонуклеазную активность, благодаря которой обеспечивается коррекция возможных ошибок. Установлено, что большинство полимераз кроме 5"-3"-полимеразной активности имеют 3"-5"- экзонуклеазную активность, благодаря которой обеспечивается коррекция возможных ошибок. Эта коррекция осуществляется в два этапа: сначала идет проверка соответствия каждого нуклеотида матрице перед включением его в состав растущей цепи, а затем перед включением в цепь следующего за ним нуклеотида. Эта коррекция осуществляется в два этапа: сначала идет проверка соответствия каждого нуклеотида матрице перед включением его в состав растущей цепи, а затем перед включением в цепь следующего за ним нуклеотида. РЕПАРАЦИЯ ДНК ЗА СЧЕТ ЭКЗОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ
При встраивании неправильного нуклеотида двойная спираль деформируется. Это позволяет ДНК-П распознать в большинстве случаев дефект в растущей цепи. Если ошибочно встроенный нуклеотид не способен формировать водородную связь с комплементарным основанием, ДНК-П приостановит процесс репликации до тех пор, пока нужный нуклеотид не встанет на его место. У эукариот ДНК-П не обладает 3-5 экзонуклеазной активностью. При встраивании неправильного нуклеотида двойная спираль деформируется. Это позволяет ДНК-П распознать в большинстве случаев дефект в растущей цепи. Если ошибочно встроенный нуклеотид не способен формировать водородную связь с комплементарным основанием, ДНК-П приостановит процесс репликации до тех пор, пока нужный нуклеотид не встанет на его место. У эукариот ДНК-П не обладает 3-5 экзонуклеазной активностью.
Репарация алкилирующих повреждений Генетические повреждения, вызываемые присоединением алкильных или метильных групп, могут репарироваться в результате удаления этих групп специфическими ферментами. Специфический фермент О 6 метилгуанин трансфераза распознает О 6 метилгуанин в ДНК и удаляет метильную группу и возвращает основание в исходную форму. Генетические повреждения, вызываемые присоединением алкильных или метильных групп, могут репарироваться в результате удаления этих групп специфическими ферментами. Специфический фермент О 6 метилгуанин трансфераза распознает О 6 метилгуанин в ДНК и удаляет метильную группу и возвращает основание в исходную форму.
Действие полинуклеотидлигазы Например, под действием ионизирующего облучения могут возникнуть однонитевые разрывы ДНК. Фермент полинуклеотидлигаза воссоединяет разорванные концы ДНК. Например, под действием ионизирующего облучения могут возникнуть однонитевые разрывы ДНК. Фермент полинуклеотидлигаза воссоединяет разорванные концы ДНК.
Этапы эксцизионной репарации 1. Узнавание повреждения ДНК эндонуклеазой 1. Узнавание повреждения ДНК эндонуклеазой 2. Инцизия (надрезание) цепи ДНК ферментом по обе стороны от повреждения 2. Инцизия (надрезание) цепи ДНК ферментом по обе стороны от повреждения 3. Эксцизия (вырезание и удаление) повреждения при помощи геликазы 3. Эксцизия (вырезание и удаление) повреждения при помощи геликазы 4. Ресинтез: ДНК-П застраивает брешь и лигаза соединяет концы ДНК 4. Ресинтез: ДНК-П застраивает брешь и лигаза соединяет концы ДНК
Мисмэтч-репарация Во время репликации ДНК бывают ошибки спаривания, когда вместо комплементарных пар А-Т, Г-Ц образуются некомплементарные пары. Неправильное спаривание затрагивает только дочернюю цепь. Система репарации мисмэтч должна найти дочернюю цепь и произвести замену некомплементарных нуклеотидов. Во время репликации ДНК бывают ошибки спаривания, когда вместо комплементарных пар А-Т, Г-Ц образуются некомплементарные пары. Неправильное спаривание затрагивает только дочернюю цепь. Система репарации мисмэтч должна найти дочернюю цепь и произвести замену некомплементарных нуклеотидов.
Мисмэтч репарация Как отличить дочернюю цепь от материнской? Как отличить дочернюю цепь от материнской? Оказывается, специальные ферменты метилазы присоединяют метильные группы к аденинам в последовательности ГАТЦ на материнскую цепь и она становится метилированной, в отличие неметилированной дочерней. У E.coli продукты 4-х генов отвечают зп мисмэтч репарацию: mut S, mut L, mut H, mut U. Оказывается, специальные ферменты метилазы присоединяют метильные группы к аденинам в последовательности ГАТЦ на материнскую цепь и она становится метилированной, в отличие неметилированной дочерней. У E.coli продукты 4-х генов отвечают зп мисмэтч репарацию: mut S, mut L, mut H, mut U.
ПОСТРЕПЛИКАТИВНАЯ РЕПАРАЦИЯ ДНК Пострепликативная репарация осуществляется в тех случаях, когда повреждение доживает до фазы репликации (слишком много повреждений, или повреждение возникло непосредственно перед репликацией) или имеет такую природу, которая делает невозможным его исправление с помощью эксцизионной репарации (например, сшивка цепей ДНК). Эта система играет особенно важную роль у эукариот, обеспечивая возможность копирования даже с поврежденной матрицы (хотя и с увеличенным количеством ошибок). Одна из разновидностей этого типа репарации ДНК - рекомбинационная репарация.
SOS -репарация Обнаружена в 1974 г. М.Радманом. Он дал название, включив в него международный сигнал бедствия. Включается тогда, когда повреждений в ДНК настолько много, что они угрожают жизни клетки. Индуцируется синтез белков, которые присоединяются к ДНК-П комплексу и строят дочернюю цепь ДНК напротив дефектной матричной. В результате ДНК удваивается с ошибкой и может произойти клеточное деление. Но если были задеты жизненно важные функции клетка погибнет. Обнаружена в 1974 г. М.Радманом. Он дал название, включив в него международный сигнал бедствия. Включается тогда, когда повреждений в ДНК настолько много, что они угрожают жизни клетки. Индуцируется синтез белков, которые присоединяются к ДНК-П комплексу и строят дочернюю цепь ДНК напротив дефектной матричной. В результате ДНК удваивается с ошибкой и может произойти клеточное деление. Но если были задеты жизненно важные функции клетка погибнет.
РЕПАРАЦИЯ ДНК И НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ ЧЕЛОВЕКА Нарушение системы репарации у человека является причиной: Преждевременного старения Онкозаболеваний (80-90 % всех раковых заболеваний) Аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артрит, СКВ, болезнь Альцгеймера)
Болезни, связанные с нарушением репарации Пигментная ксеродерма Пигментная ксеродерма Атаксия-телеангиэктазия или синдром Луи-Бар Атаксия-телеангиэктазия или синдром Луи-Бар Синдром Блума Синдром Блума Трихотиодистрофия (ТТД) Трихотиодистрофия (ТТД) Синдром Коккейна Синдром Коккейна Анемия Фанкони Анемия Фанкони Прогерия детей (синдром Хатчинсона-Гилфорда) Прогерия детей (синдром Хатчинсона-Гилфорда) Прогерия взрослых (синдром Вернера) Прогерия взрослых (синдром Вернера)
Атаксия-телеангиэктазия или синдром Луи- Бар: А-Р, мозжечковая атаксия, нарушение координации движений, телеангиэктазы – локальное чрезмерное расширение мелких сосудов, иммунодефицит, предрасположенность к онкозаболеваниям. Синдром Блума: А-Р, высокая чувствительность к УФ лучам, гиперпигментация, краснота на лице в виде бабочки.
Трихотиодистрофия: А-Р, нехватка серы в клетках волос, ломкость, напоминают тигровый хвост, аномалии кожи, зубов, дефекты полового развития. Синдром Коккейна: А-Р, карликовость при норме гормонов роста, глухота, атрофия зрительного нерва, ускорение старения, чувствительны к солнечному свету. Анемия Фанкони: уменьшение кол-ва всех клеточных элементов крови, скелетные нарушения, микроцефалия, глухота. Причина- нарушение вырезания пиримидиновых димеров и нарушение репарации межцепочечных сшивок ДНК.
Литература: 1. Генетика. Под ред. Иванова В.И. М., Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск, Муминов Т.А., Куандыков Е.У. Основы молекулярной биологии (курс лекций). Алматы, Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. М., 2003.
РЕПАРАЦИЯ ДНК
Системы репарации
2 Эксцизионная репарация. Примеры и виды
3 Репарация ошибок репликации ДНК
4 Рекомбинантная (пострепликативная) репарация у бактерий
5 SOS-репарация
Системы репарации ДНК достаточно консервативны в эволюции от бактерий до человека и наиболее изучены у Е. coli.
Известны два типа репарации: прямая и эксцизионная
Прямая репарация
Прямая репарация - наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов.
1. Так действует, например, О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза
(фермент – самоубийца), которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина
У Е. coli может в 1 мин синтезироваться до 100 молекул этого белка. Аналогичный по функциям белок высших эукариот, очевидно, играет важную роль в защите от рака, вызываемого внутренними и внешними алкилирующими факторами.
ДНК-инсертаза
2. ДНК-инсертазами
фотолиаза
3. Тиминовые димеры "расшиваются" путем прямой репарацци при участии фотолиаз , осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение . ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны 300 - 600 нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр.
Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий, земноводных и человека. Эти ферменты нуждаются в разнообразных кофакторах (FADH, тетрагидрофолиевая кислота и др.), участвующих в фотохимической активации фермента. Фотолиаза Е. coli представляет собой белок с молекулярной массой 35 кДа, прочно связанный с олигорибонуклеотидом длиной 10-15 нуклеотидов , необходимым для активности фермента.
Примеры прямой репарации
1. Метилированное основание O 6- mG диметилируется ферментом метилтрансфераза О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (фермент – самоубийца), которая переносит метильную группу на один из своих остатков
цистеина
2. АР-сайты могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНК-инсертазами (от англ. insert- вставлять).
СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК – метилированное основание O 6- mG демитилируется ферментом метилтрансферазой, который переносит метильную группу на один из своих остатков аминокислоты цистеина.
3. Фотолиаза присоединяется к тиминовому димеру и после облучения этого комплекса видимым светом (300-600 нм) димер расшивается
СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК – Фотолиаза
присоединяется к тиминовому димеру и после облучения видимым спектром света этот димер расшивается
Эксцизионная репарация
(от англ. excision - вырезание).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Эксцизионная репарация включает удаление поврежденных азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.
МЕХАНИЗМ
В эксцизионной репарации обычно принимают участие несколько ферментов, а сам процесс затрагивает
не только поврежденный ,
но и соседние с ним нуклеотиды .
УСЛОВИЯ
Для эксцизионной репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК. Общая упрощенная схема эксцизионной репарации представлена на рис. 171.
ЭТАПЫ
Первым этапом эксцизионной репарации является вырезание аномальных азотистых оснований. Его катализируют группа ДНК- N -гликозилаз - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием.
ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ:
У человека ДНК- N -гликозилазы обладают высокой субстратной специфичностью: разные ферменты этого семейства распознают и вырезают различные аномальные основания (8-оксогуанин, урацил, метилпурины и др.).
У бактерий ДНК- N -гликозилазы такой субстратной специфичностью не обладает
ОБЩИЕ ФЕРМЕНТЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ
| НАЗВАНИЕ | ФУНКЦИЯ | МЕХАНИЗМ |
| ДНК- N -гликозилазы | вырезание аномальных азотистых оснований | расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием |
| АР-эндонуклеаза | создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы | разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте |
| экзонуклеаза | выщепляет несколько нуклеотидов | последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК |
КОНКРЕТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫЕ ШАГИ ЭТОГО МЕХАНИЗА:
В результате действия ДНК- N -гликозилаз образуется АР-сайт, который атакуется ферментом АР-эндонуклеазой . Она разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте и тем самым создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы , которая последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК.
В клетках бактерий освобожденное место заполняется соответствующими нуклеотидами при участии ДНК-полимеразы I , ориентирующейся на вторую (комплементарную) цепь ДНК.
Поскольку ДНК-полимераза I способна удлинять З"-конец одной из цепей в месте разрыва в двуцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5"-конца того же разрыва,
т.е. осуществлять “ник-трансляцию” , этот фермент играет ключевую роль в репарации ДНК. Окончательное сшивание репарированных участков осуществляет ДНК-лигаза .
В клетках эукариот (млекопитающих)
Эксцизионная репарация ДНК в клетках млекопитающих сопровождается резким всплеском активности еще одного фермента – поли А D Р-рибозо-полимеразы . При этом происходит ADP-рибозилирование белков хроматина (гистонов и негистоновых белков), что ведет к ослаблению их связи с ДНК и открывает доступ ферментам репарации.
Донором ADP-рибозы в этих реакциях выступает NAD+ , запасы которого сильно истощаются при эксцизионной репарации повреждений, вызываемых рентгеновским облучением:
Отрицательно заряженные остатки ADP-рибозы из внутреннего состава молекулы NAD+ присоединяются через радикал глутаминовой кислоты или фосфосерина к белкам хроматина, что ведет к нейтрализации положительных зарядов этих белков и ослаблению их контакта с ДНК.
ЧТО ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ГРУППА ФЕРМЕНТОВ
ДНК – гликозилазы
расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием
что приводит к вырезанию аномальных азотистых оснований
ДНК - гликозилазы , участвующие в устранении окислительных повреждений ДНК в клетках прокариот и эукариот , весьма разнообразны и отличаются по субстратной специфичности, пространственной структуре и способам взаимодействия с ДНК.
К наиболее изученным ДНК-гликозилазам относятся:
эндонуклеаза III (EndoIII),
форм амидо пиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg),
Mut T и
Mut Y кишечной палочки.
Эндонуклеаза III Е. coli "узнает" и специфически выщепляет из ДНК окисленные пиримидиновые основания.
Этот фермент представляет собой мономерный глобулярный белок, состоящий из 211 аминокислотных остатков (мол. масса 23,4 кДа). Ген, кодирующий Endo III, секвенирован, установлена его нуклеотидная последовательность. Endo III представляет собой железосерный белок [(4 Fe -4 S )2+-белок], обладающий элементом надвторичной структуры типа "греческий ключ" (спираль - шпилька - спираль), служащим для связывания с ДНК . Ферменты с аналогичной субстратной специфичностью и сходной аминокислотной последовательностью выделены также из клеток быка и человека .
Форм амидо пиридин-ДНК-гликозилаза Е. coli "узнает" и выщепляет из ДНК окисленные гетероциклические основания пуринового ряда .
СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ СТАДИЯ 1
ДНК N
СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ
1 ДНК N гликозидаза удаляет поврежденное основание
АР эндонуклеаза вносит разрыв в ДНК
2 Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов
3 ДНК полимераза заполняет освободившийся участок комплементарными
Мононуклеотидами
ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК
Mut T - небольшой белок с молекулярной массой 15 кДа, обладающий нуклеозидтрифосфатазной активностью, который преимущественно гидролизует dGTP до dGMP и пирофосфата.
Биологическая роль Mut T заключается в предотвращении образования во время репликации неканонических пар А:G и А: 8-oxo-G .
Такие пары могут появляться в том случае, когда окисленная форма
dGTP (8-oxo-dGTP) становится субстратом ДНК-полимеразы.
Mut T гидролизует 8-oxo-dGTP в 10 раз быстрее, чем dGTP.
Это делает 8-oxo-dGTP наиболее предпочтительным субстратом Mut T и объясняет его функциональную роль.
Mut Y представляет собой специфическую аденин-ДНК-гликозилазу, расщепляющую N-гликозидную связь между аденином и дезоксирибозой аденозина, образующего неканоническую пару с гуанином.
Функциональная роль этого фермента заключается в предотвращении мутации
T:A - G:A путем отщепления неповрежденного остатка аденина из пары оснований A: 8-oxo-G.
Нуклеотидная эксцизионная репарация
(АТФ-зависимый механизм удаления повреждений из ДНК)
В последнее время в эксцизионной репарации особое внимание уделяют АТР-зависимому механизму удаления повреждений из ДНК. Этот вид эксцизионной репарации получил название нуклеотидная эксцизионная репарация (nucleotide excision repair; NER).
Она включает в себя ДВА ЭТАПА :
1. удаление из ДНК олигонуклеотидных фрагментов , содержащих повреждение, и
Эксинуклеаза
2. последующую реконструкцию цепи ДНК с участием комплекса ферментов (нуклеаз, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и др.).
Удаление фрагмента ДНК происходит по обе стороны поврежденного нуклеотида. Длина удаляемых олигонуклеотидных фрагментов отличается у прокариот и эукариот.
Удаление фрагмента ДНК у прокариот
Так, у Е. coli, В. subtilus, Micrococcus luteus вырезается фрагмент длиной 12-13 нуклеотидов,
Удаление фрагмента ДНК у эукариот
а у дрожжей, земноводных и человека - фрагмент, состоящий из 24-32 нуклеотидов.
Эксинуклеаза – фермент, удаляющий фрагменты ДНК
Выщепление фрагмента ДНК осуществляется ферментом эксинуклеазой (excinuclease). У Е. coli этот фермент состоит из 3 различных протомеров –
uvrA
uvr В
uvr С
каждый из которых выполняет определенную функцию в ходе эксцизионного выщепления фрагмента ДНК. Название этих белков дано по первым буквам слов "ultra violet repair".
Протомер uvr А обладает АТРазной активностью, связывается с ДНК в виде димера, осуществляя
первичное распознавание повреждения и
связывание uvr В
Протомер uvr В обладает:
1 . Латентной АТР-азной и латентной хеликазной активностью, необходимой для изменения конформаций и расплетания двойной спирали ДНК;
2. Эндонуклеазной активностью, расщепляя межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь со стороны З"-конца выщепляемого фрагмента.
Протомер uvr С действует как эндонуклеаза , вносящая разрыв в репарируемую цепь ДНК с 5"-конца вырезаемого фрагмента.
Таким образом, протомеры uvr A, uvr В, uvr С взаимодействуют с ДНК в определенной последовательности, осуществляя АТР-зависимую реакцию выщепления олигонуклеотидного фрагмента из репарируемой цепи ДНК.
Образовавшаяся брешь в молекуле ДНК реставрируется при участии ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы. Модель эксцизионной репарации с участием вышеперечисленных ферментов представлена на рис. 172.
Эксцизионные репарации у человека
Эксцизионные репарации у человека также имеют АТФ - зависимый характер и включают три основных этапа :
узнавание повреждения,
двойное разрезание цепи ДНК,
восстановительный синтез и
лигирование репарируемой цепи.
Однако, в эксцизионной репарации ДНК человека принимают участие
25 различных полипептидов ,
16 из которых участвуют в выщеплении олигонуклеотидного фрагмента, являясь протомерами эксинуклеазы ,
а остальные 9 осуществляют синтез репарируемого участка молекулы.
В репарационной системе ДНК у человека весьма существенную роль выполняют белки транскрипции –
РНК-полимераза II и
TF ПН - один из шести основных факторов транскрипции эукариот .
Следует отметить, что эксцизионная репарация у прокариот, как и у эукариот, зависит от функционального состояния ДНК:
транскрибируемая ДНК репарируется быстрее,
чем транскрипционно неактивная.
Этот феномен объясняется следующими факторами:
структурой хроматина,
гомологией цепей транскрибируемых участков ДНК,
эффектом повреждения цепей и его влиянием на РНК-полимеразу.
ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ:
КОДИРУЮШАЯ ЦЕПЬ ДНК (цепь хранения информации)
МАТРИЧНАЯ ЦЕПЬ ДНК (с неё происходит списывание информации)
Известно, что такие крупные повреждения, как образование тиминовых димеров , блокируют транскрипцию как у бактерий, так и у человека, если они происходят на матричной цепи ДНК (повреждения на кодирующей цепи не влияют на транскрипционный комплекс). РНК-полимераза останавливается в месте повреждения ДНК и блокирует работу транскрипционного комплекса.
Транскрипционно-репарационный фактор сцепления (TRCF) .
У Е. coli усиление репарации при транскрипции опосредуется одним специальным белком - транскрипционно-репарационным фактором сцепления (TRCF) .
Этот белок способствует :
1. отсоединению РНК-полимеразы от ДНК
2. одновременно стимулирует образование комплекса белков,
Осуществляющих репарацию поврежденного участка.
По окончании репарации РНК-полимераза встает на место и транскрипция продолжается (см. рис.).
Итак общая схема эксцизионной репарации
1. ДНК- N -гликозилаза удаляет поврежденное основание
2. АР –эндонуклеаза вносит разрыв в цепь ДНК
3. Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов
4. ДНК-полимераза заполняет освободившийся участок
Комплементарными нуклеотидами
5. ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК
Репарация ошибок репликации ДНК
путем метилирования
Ошибки спаривания азотистых оснований во время репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на 10 тыс. нуклеотидов), в результате которых в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотидам материнской цепи нуклеотиды - мисмэтчи (англ. mismatch н е соответствовать ).
Несмотря на то, что ДНК-полимераза I прокариот обладает способностью к самокоррекции, ее усилия по устранению ошибочно присоединенных нуклеотидов иногда оказываются недостаточны , и тогда в ДНК остаются некоторые неправильные (некомплементарные) пары.
В этом случае репарация происходит с использованием определенной системы, связанной с метилированием ДНК . Действие этой системы репарации основано на том, что после репликации через определенное время (несколько минут) ДНК подвергается метилированию.
У Е. coli метилируется в основном аденин с образованием
N6-мeтил-аденина (N6-mA).
До этого момента вновь синтезированная (дочерняя) цепь остается неметилированной.
Если в такой цепи есть неспаренные нуклеотиды, то она подвергается репарации: Таким образом метилирование метит ДНК и
включает систему исправления ошибок репликации.
В этой системе репарации узнаются особые структуры:
последовательность G-N6-mA-T-С и следующая за ней деформация
в двойной спирали в месте отсутствия комплементарности (рис. ниже).
В устранении неспаренных нуклеотидов в полуметилированной молекуле ДНК принимает участие достаточно сложный комплекс ферментов репарации, который сканирует поверхность молекулы ДНК, вырезает участок дочерней цепи , прибегающей к мисмэтчам , а затем создает условия для застраивания
его нужными (комплементарными) нуклеотидами.
Различные компоненты этого комплекса обладают разными активностями нуклеазной,
хеликазной,
АТРазной,
необходимыми для внесения разрывов в ДНК и выщепления нуклеотидов, расплетания двойной спирали ДНК и энергетического обеспечения движения комплекса вдоль репарируемой части молекулы.
Сходный по структуре и функциям комплекс ферментов репарации выявлен и у человека.
Рекомбинантная (пострепликативная) репарация
В тех случаях, когда по тем или иным причинам вышерассмотренные системы репарации оказываются нарушенными, в цепях ДНК могут образовываться бреши (недорепарированные участки), имеющие иногда весьма существенные размеры , что чревато нарушением системы репликации и может привести к гибели клеток.
В этом случае клетка в состоянии использовать для репарации одной молекулы ДНК другую полученную после репликации молекулу ДНК, т. е. привлечь для этой цели механизм рекомбинации .
У бактерий
У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие белок Rec А . Он связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными участками неповрежденных цепей другой молекулы ДНК .
В результате и разорванная (содержащая бреши), и неповрежденная цепи репарируемой молекулы ДНК оказываются спаренными с неповрежденными комплементарными участками ДНК, что открывает возможность репарации путем вышеохарактеризованных систем.
При этом могут происходить вырезание определенного фрагмента и
заполнение с его помощью бреши в дефектной цепи.
Возникающие при этом пробелы и разрывы в цепях ДНК восполняются с участием ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы .
SOS-репарация
Существование этой системы впервые постулировал М. Радман в 1974 г. Он же дал название этому механизму, включив в него международный сигнал бедствия "SOS" (спасите наши души).
И действительно, эта система включается тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки . В этом случае происходит индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах, сопряженных с репарацией ДНК.
Включение тех или иных генов, определяемых количеством повреждений в ДНК, приводит к разным по значимости клеточным ответам (начиная со стандартной репарации поврежденных нуклеотидов и кончая подавлением клеточного деления).
Наиболее изучена SOS-репарация у Е. coli, главными участниками которой являются белки, кодируемые генами Rec A и Lex А .
Первый из них представляет собой полифункциональный белок Rec A , участвующий
в рекомбинации ДНК , а также
в регуляции транскрипции генов фага лямбда , поражающего Е. coli,
а второй (белок Lex А) является репрессором транскрипции большой группы генов, предназначенных для репарации ДНК бактерий. При его ингибировании или разрешении репарация активируется.
Связывание Rec А с Lex А приводит к расщеплению последнего и соответственно к активации генов репарации .
В свою очередь, индукция SOS-системы бактерии служит для фага лямбда сигналом опасности и приводит к тому, что профаг переключается с пассивного на активный (литический) путь существования, вызывая тем самым гибель клетки-хозяина .
SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у животных, и человека.
Гены, задействованные в SOS-репарации повреждений ДНК
| Гены | Последствия активации гена |
| uvr А, В, С, D | Репарация повреждений вторичной структуры ДНК |
| Rec А | Пострепликативная репарация, индукции SOS-системы |
| lex А | Выключение SOS-системы |
| rec N, ruv | Репарация двунитевых разрывов |
| Обеспечение рекомбинационной репарации |
|
| umu С, D | Мутагенез, вызванный изменениями свойств ДНК-полимеразы |
| sul А | Подавление клеточного деления |
Заключение
Исправление повреждений в ДНК тесным образом связано с другими фундаментальными молекулярно-генетическими процессами: репликацией, транскрипцией и рекомбинацией. Все эти процессы оказываются переплетенными в общую систему взаимодействий, обслуживаемую большим числом разнообразных белков, многие из которых являются полифункциональными молекулами, задействованными в контроле реализации генетической информации в клетках про- и эукариот. В то же время очевидно, что природа "не скупится" на элементах контроля, создавая сложнейшие системы коррекции тех повреждений в ДНК, которые несут опасность для организма и особенно для его потомства. С другой стороны, в тех случаях, когда репарационных возможностей недостаточно для сохранения генетического статуса организма, наступает необходимость в программируемой клеточной смерти – апоптозе. .
СХЕМА НУКЛЕОТИДНОЙ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ У E . COLI С УЧАСТИЕМ ЭКСИНУКЛЕАЗЫ
1. ТРАНСКРИПЦИОННО НЕЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ
2. ТРАНСКРИПЦИОННО ЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ
3. ОБЩИЙ ЭТАП РЕПАРАЦИИ
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
А - белок uvr А
Б - белок uvr В
С - белок uvr С
маленький черный треугольник – знак указывает на место повреждений
СХЕМА РЕПАРАЦИИ, СВЯЗАННАЯ С МЕТИЛИРОВАНИЕМ ДНК
Синтез ДНК происходит по полуконсервативному механизму: каждая цепь ДНК копируется. Синтез происходит по участкам. Существует система, устраняющая ошибки при редупликации ДНК (фоторепарация, дорепродуктивная и пострепродуктивная репарации ). Процесс репарации очень долог: до 20 часов, и сложен. Ферменты – рестриктазы вырезают неподходящий участок ДНК и достраивают его заново. Репарации никогда не протекают со 100% эффективностью, если бы это было, Не существовала бы эволюционная изменчивость. Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной, т.е. с вырезанием. Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной. В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации. Постреплекативная репарация осуществляется путем рекомбенации между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть поврежденной структуры ДНК. Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится.
19.Ген, его свойства. Генетический код, его свойства. Структура и виды РНК. Процессинг, сплайсинг. Роль РНК в процессе реализации наследственной информации.
Ген – участок молекулы ДНК, который несет информацию о структуре полипептидной цепи или макромолекулы. Гены одной хромосомы располагаются линейно, образую группу сцепления. ДНК в хромосоме выполняет разные функции. Существуют разные последовательности генов, есть последовательности генов, контролирующих экспрессию генов, репликацию и др. Есть гены, содержащие информацию о структуре полипептидной цепи, в конечном счете – структурных белках. Такие последовательности нуклеотидов длинной в один ген, называются структурными генами. Гены, определяющие место, время, длительность включения структурных генов – регуляторные гены.
Гены имеют маленький размер, хотя состоят из тысяч пар нуклеотидов. Наличие гена устанавливается по проявлению признака гена (конечному продукту). Общую схему строения генетического аппарата и его работы в 1961 году предложили Жакоб, Моно. Они предложил, что есть участок молекулы ДНК с группой структурных генов. К этой группе примыкает участок в 200пар нуклеотидов – промотор (участок примыкания ДНК зависимой РНК-полимеразы). К этому участку примыкает ген-оператор. Название всей системы – оперон. Регуляция осуществляется регуляторным геном. В итоге белок-репрессор взаимодействует с геном-оператором, и оперон начинает работать. Субстрат взаимодействует с геном регуляторами, оперон блокируется. Принцип обратной связи. Экспрессия оперона включается как единое целое.
У эукариот экспрессия генов не исследована. Причина – серьезные препятствия:
Организация генетического материала в форме хромосом
У многоклеточных организмов клетки специализированы и поэтому часть генов выключена.
Наличие гистоновых белков, в то время как у прокариот - «голая» ДНК.
ДНК – макромолекула, она не может выходить в цитоплазму из ядра и передавать информацию. Синтез белка возможен благодаря м-РНК. В эукариотической клетке транскрипция происходит с огромной скоростью. Сначала возникает про-и-РНК или пре-и-РНК. Это объясняется тем, что у эукариот и-РНК образуется в результате процессинга (созревания). Ген имеет прерывистую структуру. Кодирующие участки – экзоны и некодирующие – интроны. Ген у эукариоических организмов имеет экзонно-интронную структуру. Длина интрона больше длины экзона. В процессе процессинга интроны «вырезаются» - сплайсинг. После образования зрелой и-РНК после взаимодействия с особым белком переходит в систему – информосому, которая несет информацию в цитоплазму. Сейчас экзоно-интронные системы хорошо изучены (например, онкоген - Р-53). Иногда интроны одного гена являются экзонами другого, тогда сплайсинг невозможен. Процессинг и сплайсинг способны объединять структуры, удаленные друг от друга, в один ген, поэтому они имеют огромное эволюционное значение. Подобные процессы упрощают видообразование. Белки имеют блочную структуру. Например, фермент – ДНК-полимераза. Он представляет собой непрерывную полипептидную цепь. Он состоит из собственной ДНК-полимеразы и эндонуклеазы, которая расщепляет молекулу ДНК с конца. Фермент состоит из 2 доменов, которые образуют 2 независимые компактные частицы, связанные полипептидным мостиком. На границе между 2мя генами ферментов находится интрон. Когда-то домены были раздельными генами, а затем – сблизились. Нарушения подобной структуры гена приводит к генным болезням. Нарушение строения интрона фенотипически незаметно, нарушение в экзонной последовательности приводят к мутации (мутации глобиновых генов).
10-15% РНК в клетке - транспортная РНК. Есть комплементарные участки. Есть специальный триплет – антикодон, триплет, не имеющий комплементарных нуклеотидов – ГГЦ. Взаимодействие 2 субъединиц рибосомы и и-РНК приводит к инициации. Имеются 2 участка – пектидильный и аминоацильный. Они соответствуют аминокислотам. Синтез полипептида происходит пошагово. Элонгация – процесс построения полипептидной цепи продолжается пока не дойдет до бессмысленного кодона, тогда происходит терминация. Оканчивается синтез полипептида, который затем поступает в каналы ЭПР. Субъединицы расходятся. В клетке синтезируются различные количества белка.
Репарация ДНК - это ее починка, т. е. исправление ошибок, возникающих в структуре молекулы. Слово «репарация» происходит от английского «repair», переводимого как «ремонт», «починка» и т. п.
Под ошибками в структуре ДНК, которые могут быть репарированы, чаще всего понимают нарушение последовательности нуклеотидов - структурных единиц, из которых состоит каждая цепь ДНК. Молекула ДНК состоит из двух цепей-нитей, комплементарных друг другу. Это значит, что если повреждения возникают в одной из цепей, то по второй неповрежденной можно восстановить испорченный участок первой. Кроме этого, в клетках эукариот каждая хромосома имеет гомологичную, т. е. содержащую тот же набор генов (но не аллелей). В крайнем случае, когда поврежден участок на обеих нитях молекулы, он может копироваться с гомологичной хромосомы. Также после S-фазы клеточного цикла , когда произошла репликация (самокопирование), каждая хромосома состоит из двух двухцепочечных идентичных друг другу хроматид, т. е. по-сути из двух идентичных молекул ДНК. Это также может быть использовано для восстановления исходной структуры поврежденной молекулы.
В процессе эволюции появилось много различных клеточных молекулярных механизмов, ответственных за репарацию ДНК. В основном это различные ферменты и их комплексы. Часть из них участвует также в репликации. Особо опасны повреждения генов, которые кодирую такие ферменты. Это приводит к утрате того или иного репарационного механизма. В этом случае в клетках происходит более быстрое накопление повреждений и мутаций. Нередко это служит причиной возникновения бесконтрольно делящихся клеток, т. е. появления опухолей.
С другой стороны, если повреждения ДНК особенно сильны, то в клетках включается механизм самоуничтожения (апоптоза ). Таким образом к делению такие клетки не допускаются, а значит следующее поколение не будет содержать значительные повреждения ДНК.
Ошибки в структуре ДНК могут возникать на различных этапах ее существования (во время синтеза, в пред- и постсинтетические периоды), по разным причинам (случайно, под действием химически активных веществ, радиации и др.). Также изменения бывают разными (потеря химической группы нуклеотида или присоединение дополнительной, замена нуклеотида на другой, установление химической связи между двумя соседними нуклеотидами, разрыв цепи, потеря участка и др.). В связи с таким разнообразием существует трудность классификации репарационных механизмов. Часто их делят на те, которые происходят во время репликации, сразу после нее и в течение остального жизненного цикла клетки. Ниже перечислены наиболее изученные причины изменения структуры ДНК и способы репарации.
Следует иметь в виду, что не все ошибки исправляются, относительно мелкие и не критичные могут передаваться следующему поколению клеток и организмов. Их нельзя назвать повреждениями, скорее - мутациями. Большинство мутаций вредны, однако те, что нейтральны или полезны в данных условиях окружающей среды, служат материалом для эволюции. Таким образом несовершенство механизмов репарации ДНК обеспечило разнообразие жизни на нашей планете.
Коррекция нуклеотидной последовательности при репликации
ДНК-полимеразы выполняют основную работу при репликации ДНК, присоединяя нуклеотид за нуклеотидом к новой цепи. Помимо основной функции, многие полимеразы способны удалять неправильно присоединенный последний нуклеотид, т. е. не комплементарный нуклеотиду матричной цепи.
Химическая структура нуклеотидов может несколько модифицироваться. При этом они начинают соединяться водородными связями не со своими комплементарными напарниками. Так, например, цитозин должен связываться с гуанином. Но его измененная форма устанавливает водородные связи с аденином, с которым должен был связаться тимин.
При синтезе новой нити ДНК очередной нуклеотид сначала связывается водородными связями с комплементарным основанием матрицы. После этого полимераза связывает его с концом растущей цепи ковалентной связью.
Однако, если это был модифицированный нуклеотид, который неправомерно связался с комплементарным основанием материнской цепи, то он обычно быстро возвращается в свою исходную форму и становится некомплементарным. Водородные связи разрываются, и получается, что конец новой цепи имеет свободно висящий нуклеотид, ковалентно связанный с синтезируемой цепью.
ДНК-полимераза в данном случае не может присоединить следующий нуклеотид, и ей ничего не остается, как только удалить этот ошибочный нуклеотид.
Если же водородные связи не разорвались, то за ошибочным нуклеотидом цепь продолжит нарастать далее, а точечная мутация сохранится. Она может быть устранена уже после репликации.
Репарация сразу после репликации
После того, как новая нить ДНК была синтезирована, определенные комплексы ферментов распознают неправильно спаренные основания. При этом существует проблема определения новой и старой цепей молекулы ДНК. Новая отличается отсутствием метилированных оснований и у эукариот наличием временных разрывов. По этим признакам ферментные комплексы идентифицируют именно вновь синтезированную цепь. Таким образом в некомплементарных парах оснований «ошибкой» считается нуклеотид новой цепи.
Как только ошибка найдена, другие ферменты вырезают целый участок ДНК, содержащий неправоменое основание, а не только один нуклеотид. После этого полимераза заново строит этот участок, а лигаза сшивает его с остальной цепью. Этот механизм, когда вырезается и вновь синтезируется участок ДНК, называется эксцизионной репарацией (от слова excision - отрезание, вырезание), он достаточно универсален и используется во многих случаях репарации, а не только при «проверке» ДНК сразу после репликации.
Репарационные механизмы при повреждении ДНК
ДНК организма может изменяться не только из-за ошибок во время репликации. Клетка живет, подвергается воздействию неблагоприятных внешних факторов, ее внутренняя биохимическая среда может изменяться, провоцируя пагубные для ДНК реакции. В результате генетический материал так или иначе повреждается. В зависимости от типа повреждения, его масштаба включаются различные репарационные механизмы, привлекающие несколько различающиеся наборы ферментативных комплексов.
1. Существуют ферменты, отменяющие изменения нуклеотидов на месте без удаления участков ДНК. Другими словами, если в цепи был нуклеотид, содержащий основание гуанин (Г), который в результате химической реакции присоединил метил-группу и превратился в метил-гуанин, то фермент превратит его обратно в гуанин. В основном подобная репарация ДНК касается присоединения-отсоединения определенных групп атомов.
2. В случае утраты пуриновых оснований может протекать эксцизионная репарация. В случае дезаминирования и некоторых других структурных изменений оснований, ферменты гликозилазы вырезают только поврежденное основание нуклеотида. И только после этого протекает стандартная эксцизионная репарация.
3. Вырезается участок и при образовании димеров, когда два соседних нуклеотида соединяются между собой. Обычно такие реакции протекают в результате воздействия ультрафиолетовых лучей. Образование димера провоцирует расхождение комплементарных нитей ДНК в этом и близлежащих участках. Образуется пузырь, который распознается ферментами. Далее запускается эксцизионная репарация.
4. Бывают столь сильные повреждения молекул ДНК, когда структура обеих ее цепей нарушается в одном и том же месте. При этом уже нельзя согласно принципу комплементарности восстановить одну цепь по другой. Одним из примеров подобного повреждения может является разрыв молекулы ДНК на две части, например, при действии сильного радиоактивного облучения.
В случае повреждения обеих нитей молекулы ДНК на помощь может прийти рекомбинативная репарация, когда вместо поврежденного участка вставляется участок с гомологичной хромосомы или сестринской хроматиды. В случае разрыва также существуют ферменты, способные обратно присоединять оторванный кусок ДНК. Однако при этом часть нуклеотидов может теряться, что в свою очередь может привести к серьезным мутациям.
Рекомбинативная репарация в пресинтетический период клеточного цикла может протекать только между гомологичными хромосомами, т. к. каждая хромосома в этот период состоит только из одной хроматиды. В постсинтетический период, когда хромосомы состоят из двух идентичных хроматид, участок может заимствоваться с сестринской хроматиды.
Следует подчеркнуть, что у сестринских хроматид набор аллелей исходно идентичен (если не было кроссинговера). У гомологичных хромосом - нет. Таким образом, настоящая рекомбинация с точки зрения генетики протекает только в случае обмена между гомологичными хромосомами. Хотя здесь в обоих случаях мы говорим о рекомбинации.
Рассмотрим такой пример. Допустим в ДНК возник тиминовый димер, который не был репарирован до репликации. В процессе репликации цепи исходной молекулы ДНК расходятся и на каждой строится новая комплементарная цепь. На той матричной цепи, которая содержит димер тимина, в этом участке не может быть построен участок новой цепи. В этом месте просто отсутствует нормальный шаблон. В дочерней нити появляется брешь, а в материнской остается димер. Т. е. данная молекула ДНК «не знает», какова правильная нуклеотидная последовательность участка.
Единственный выход в данном случае – позаимствовать кусок ДНК с другой хроматиды. Он переносится с одной из ее цепей. Образовавшаяся здесь брешь застраивается по шаблону комплементарной цепи. Перенесенный участок на поврежденной молекуле застраивает брешь дочерней цепи, материнская так и продолжит содержать димер, который может быть репарирован позже.